TỐI ƯU QUY TRÌNH ALLELE SPECIFIC REAL TIME PCR ĐỊNH LƯỢNG ĐỘT BIẾN JAK2 V617F

Vũ Thị Hải Yến; Hà Thị Anh; Nguyễn Tuấn Anh; Huỳnh Thị Thu Thảo; Ngô Thị Sa Ly

doi:10.59294/HIUJS.KHTT.2026.007

Từ khóa:

Allele specific realtime PCR, JAK2 V617F, đa hồng cầu, tăng sinh tuỷ

Tóm tắt

Đặt vấn đề: Đột biến JAK2 V617F là tiêu chuẩn quan trọng trong chẩn đoán và tiên lượng các bệnh tăng sinh dòng tủy, việc phát hiện đột biến ở tần suất alen thấp vẫn còn gặp nhiều khó khăn, đòi hỏi các kỹ thuật có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Mục tiêu nghiên cứu: Tối ưu hóa quy trình allele-specific real-time PCR (AS qPCR) nhằm định lượng chính xác đột biến JAK2 V617F. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: Phản ứng AS-qPCR sử dụng mồi và mẫu dò Taqman để phân biệt ba kiểu gen: hoang dại, đột biến, và hỗn hợp. Các điều kiện phản ứng: nhiệt độ lai, nồng độ mồi và nồng độ mẫu dò được tối ưu lần lượt. Kết quả: Điều kiện tối ưu với nhiệt độ lai 65°C, nồng độ mồi 400 nM và mẫu dò 150 nM, độ nhạy bị ảnh hưởng bởi sự hiện diện của allele hoang dại, cho thấy hiện tượng cạnh tranh khuếch đại. Kết luận: Quy trình AS qPCR sau tối ưu là kỹ thuật tin cậy và có thể ứng dụng trong định lượng đột biến JAK2 V617F. Cần tiếp tục đánh giá trên mẫu lâm sàng.

Abstract

Background: JAK2V617F mutation is a critical criterion for the diagnosis and prognosis of myeloproliferative neoplasms. Detecting this mutation at low variant allele frequencies remains challenging, necessitating techniques with high sensitivity and specificity. Objectives: To optimize an allele-specific real-time PCR (AS-qPCR) assay for the accurate quantification of the JAK2V617F mutation. Materials and Methods: The AS-qPCR assay utilized specific primers and TaqMan probes to differentiate between three genotypes: wild-type, mutant, and heterozygous/mixed. Reaction conditions, including annealing temperature, primer concentration, and probe concentration, were systematically optimized. Results: The optimal reaction conditions were established at an annealing temperature of 65°C, with primer and probe concentrations of 400 nM and 150 nM, respectively. The analytical sensitivity was influenced by the presence of the wild-type allele, indicating a competitive amplification phenomenon between the two templates. Conclusion: The optimized AS-qPCR protocol is a reliable technique suitable for the quantification of the JAK2V617F mutation. Further validation using clinical samples is required to confirm its diagnostic utility.

Tài liệu tham khảo

[1] X. Hu, J. Li, M. Fu, X. Zhao, and W. Wang, “The JAK/STAT signaling pathway: From bench to clinic,” Signal Transduction and Targeted Therapy, vol. 6, no. 1, p. 402, 2021, doi: 10.1038/s41392- 021-00791-1.

[2] U. Gianelli, J. Thiele, A. Orazi, N. Gangat, A. M. Vannucchi, A. Tefferi, and H. M. Kvasnicka, “International Consensus Classification of myeloid and lymphoid neoplasms: Myeloproliferative neoplasms,” Virchows Archiv, vol. 482, no. 1, pp. 53-68, 2023, doi: 10.1007/s00428-022-03430-4

DOI: https://doi.org/10.1007/s00428-022-03480-8

[3] J.-J. Kiladjian et al., “Pegylated interferon-alfa-2a induces complete hematologic and molecular responses with low toxicity in polycythemia vera,” Blood, vol. 112, no. 8, pp. 3065-3072, 2008.

[4] N. T. Ngọc, B. B. Hậu, P. H. Nam, T. T. Anh, Đ. T. Trang, and N. T. Xuân, “Đánh giá một số phương pháp xác định đột biến JAK2 V617F phục vụ việc dự đoán nguy cơ mắc bệnh đa hồng cầu và một số căn bệnh tăng sinh tuỷ ác tính khác,” 2021.

[5] J. Poodt, R. Fijnheer, I. Walsh, and M. Hermans, “A sensitive and reliable semi-quantitative realtime PCR assay to detect JAK2 V617F in blood,” Hematological Oncology, vol. 24, no. 4, pp. 227- 233, 2006.

DOI: https://doi.org/10.1002/hon.800

[6] E. Hammond, K. Shaw, B. Carnley, S. P’ng, I. James, and R. Herrmann, “Quantitative determination of JAK2 V617F by TaqMan: An absolute measure of averaged copies per cell that may be associated with the different types of myeloproliferative disorders,” The Journal of Molecular Diagnostics, vol. 9, no. 2, pp. 242-248, 2007.

DOI: https://doi.org/10.2353/jmoldx.2007.060125

[7] N. Kröger et al., “Monitoring of the JAK2-V617F mutation by highly sensitive quantitative realtime PCR after allogeneic stem cell transplantation in patients with myelofibrosis,” Blood, vol. 109, no. 3, pp. 1316-1321, 2007.

[8] S. A. Bustin, The PCR Revolution: Basic Technologies and Applications. Cambridge, U.K.: Cambridge University Press, 2009.

[9] P. H. Vân, PCR và các vấn đề cơ bản trong y sinh học phân tử. Hà Nội, Việt Nam: Nhà xuất bản Y học, 2009.

[10] E. C. Wolstencroft, K. Hanlon, L. W. Harries, G. R. Standen, A. Sternberg, and S. Ellard, “Development of a quantitative real-time polymerase chain reaction assay for the detection of the JAK2 V617F mutation,” The Journal of Molecular Diagnostics, vol. 9, no. 1, pp. 42-46, 2007.

DOI: https://doi.org/10.2353/jmoldx.2007.060083

[11] S. Zhao et al., “Impact of JAK2V617F mutation burden on disease phenotype in Chinese patients with JAK2V617F-positive polycythemia vera (PV) and essential thrombocythemia (ET),” International Journal of Medical Sciences, vol. 13, no. 1, p. 85, 2016, doi: 10.7150/ijms.13457.

[12] E. Lippert et al., “Concordance of assays designed for the quantification of JAK2V617F: A multicenter study,” Haematologica, vol. 94, no. 1, p. 38, 2009.